انتقال ژن شبه تئوماتین tlp-3 یه گیاه توتون

حفظ شرایط مطلوب رشد و نمو گیاهان، همواره مورد توجه دانش پژوهان قرار داشته است. هر گیاه در طبیعت مورد حمله هزاران میکروارگانیسم قرار می گیرد ولی توسط تعداد کمی از آن ها بیمار می شود. هماهنگی واکنش های دفاعی مختلف در مواجه با پاتوژن ها منجر به تحریک رونویسی تعدادی زیادی از ژن های دفاعی می شود. یک دسته مهم از این ژن ها، ژن های رمز کننده پروتیین های مرتبط با بیماری زایی هستند. اهمیت این پروتیین ها خصوصاً به دلیل دارا بودن فعالیت ضد میکروبی بر علیه انواع میکروارگانیسم ها است. تا کنون 17 گروه از از پروتیین های مرتبط با بیماری زایی در گیاهان تک لپه و دو لپه شناسایی شده است که در گروه پنجم این طبقه بندی، پروتیین های شبه تیوماتین قرار می گیرند. پروتیین های شبه تیوماتینی که دارای توالی سیگنال پپتید در قسمت n ترمینال هستند احتمالاً حالت اسیدی تا خنثی داشته و به سمت خارج سلول هدف گیری می شوند، در حالی که اگر این پروتیین ها توالی سیگنال پپتید را در قسمت cترمینال دارا باشند احتمالاً حالت بازی داشته و به سمت واکویل میل می کنند. در راستای دست یابی به گیاهان مقاوم در برابر عوامل بیماری زا، انتقال ژن شبه تیوماتین tlp-3 که ازگیاه یونجه یکساله گزارش گردیده به گیاه مدل توتون مد نظر قرار گرفت. در ابتدا توالی سیگنال پپتید این ژن با کمک نرم افزار signalp شناسایی و با توجه به اینکه این توالی در قسمت nترمینال قرار داشت، طراحی آغازگرهای اختصاصی برای تکثیر ژن مورد نظر توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز به دو شکل با و بدون سیگنال پپتید جهت هدف گیری پروتیین به ترتیب به خارج و داخل سلول انجام شد. در مرحله بعد کشت بافت گیاه یونجه یکساله از طریق کشت بذر بر روی محیط ms صورت گرفت. پس از استخراج dna از گیاه یونجه یکساله، تکثیر و جداسازی ژن مورد نظر توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز در حضور آنزیم های pfu پلیمراز و taq پلیمراز انجام شد. به منظور سهولت در نگه داری و دسترسی ضروری به ژن tlp-3، این ژن به درون ناقل pbluescript ii sk plus (psk) متصل و جهت همسانه سازی به e. coli xl1blue و e. coli mc1061 منتقل گردید. در ادامه ژن مورد نظر، به درون ناقل pbi121 متصل و به منظور افزایش تعداد پلاسمید های pbi121 حاوی ژن tlp-3 و همچنین افزایش امکان دستریی به این پلاسمید در مواقع ضروری همسانه سازی آن درe. coli xl1blue انجام شد. در انتها جهت انتقال پلاسمید pbi121 حاوی ژن، به گیاه توتون، پلاسمید مذکور به باکتری agrobacterium tumefaciens منتقل شد. پس از کشت بافت گیاه توتون بر روی محیط ms، برگ های این گیاه جهت تلقیح با باکتری a. tumefaciens حاوی دستواره pbi121 مورد استفاده قرار گرفت. سپس ریز نمونه ها بر روی محیط ms حاوی 100 میلی گرم بر لیتر کانامایسن و 500 میلی گرم بر لیتر سفاتوکسیم قرار گرفتند. جوانه های تولیدی از کالوس ایجاد شده بر روی ریزنمونه های حاوی ژن مورد نظر پس از جدا سازی به محیط جدید منتقل شدند. پس از اینکه گیاهان توتون، در شرایط درون شیشه به رشد مناسب رسیدند، به گلدان انتقال یافتند. در این مرحله استخراج dna از گیاهان تراریخت انجام شد و در ادامه، آزمون pcr، حضور ژن tlp-3 به دو شکل با و بدون سیگنال پپتید را تایید کرد. همچنین آزمون rt-pcr که بعد از استخراج rna از این گیاهان انجام شد، سنتز mrna ژن tlp-3 به دو شکل با و بدون سیگنال پپتید را تایید نمود. استخراج عصاره گیاهان تراریخت باعث آشکار شدن توان پروتیین tlp-3 در جلوگیری از رشد قارچ alternaria alternata، شد. انجام مطالعات گلخانه ای نیز نمایانگر توان فعالیت ژن دارای سیگنال پپتید در جلوگیری از بیماری زایی قارچ a. alternata بود.